Functional analysis of ldlr genetic variants identified in hypercholesterolemic patients in brazil, USING CRISPR/CAS9

BACKGROUND AND AIMS: Introduction: The familial hypercholesterolemia (FH) is one of the main causes of cardiovascular diseases, and it is mainly caused by genetic variants at the low-density lipoprotein receptor (LDLR). Although ultrasequencing technology has allowed the identification of several genetic variants, few of them was functional analyzed. The CRISPR/ Cas9 tool promotes precise genetic editing and allows the creation of experimental models, therefore contributing to the functional validation process. Aim: To use the CRISPR/Cas9 tool to perform in vitro functional analysis of LDLR variants identified in FH patients. METHODS: Two missense LDLR variants were selected within a group of variants identified in FH patients, based on in silico data, the affected protein domain and MAF. Three sgRNAs were designed for each of the variants c.551G>A and c.1118G>A, to analyze the accuracy of the sgRNAs. The sgRNAs were inserted on PX458 plasmid, cloned, purified in E. coli DH5a, and then co-transfected with the DNA template at HepG2 cells. The DNAs templates were designed to contain the selected variants. RESULTS: HepG2 cells co-transfected with PX458 constructs and DNA templates showed considerably transfection rate, being possible to visualize it at fluorescence microscopy. However, it was noted that single transfection of sgRNAs showed a higher transfection efficiency than cotransfection. CONCLUSIONS: We designed sgRNA for c.551G>A and c.1118G>A variants, being able to analyze the transfection efficiency. In further steps, we will select new sgRNAs for LDLR variants that have not been described yet, and functional analysis will be performed to determine the clinical relevance of these variants.

Análise funcional in silico das variantes no gene da APOB em pacientes com hipercolesterolemia familial / In silico functional analysis of variants in the APOB gene in patients with familial hypercholesterolemia

INTRODUÇÃO: O diagnóstico molecular da hipercolesterolemia familial (HF) é atribuído principalmente as variantes nos genes LDLR, LDLRAP1, APOB e PCSK9. O objetivo deste estudo foi realizar análise in silico para investigar o impacto de variantes sem descrição na literatura no gene APOB observado em pacientes com HF. MÉTODOS: Foram selecionados 141 indivíduos com diagnóstico clínico de HF. As variantes no gene da APOB foram selecionadas após sequenciamento dos éxons de 61 genes utilizando a plataforma MiSeq (Illumina). Os dados foram analisados nos programas Real Time Analysis, MiSeq Reporter, BaseSpace Sequence Hub e VariantStudio. Para a análise in silico, as sequências molde das moléculas da apoB-100 e o LDLr foram selecionadas por modelagem comparativa considerando o maior grau de identidade. As sequências proteicas foram alinhadas e os modelos 3D foram construídos utilizando os programas SEAVIEW e MODELLER v9.21. O gráfico de Ramachandran do modelo de menor energia apresenta 0,5% de outliers e análise de regiões de desordem, como principal validação. Os resultados das conformações de ancoragem foram analisados no software PyMol 2.1. Os estudos de docking molecular foram realizados para identificar o melhor complexo de conformação usando o servidor web clusPRO. RESULTADOS: Após a análise molecular dos 141 pacientes foram identificadas 7 variantes missenses sem descrição na literatura no gene APOB (c.433C>T, c.2630C>T, c.2950G>A, c.5743G>A, c.7367C>A, c.9880T>C e c.10780T>C). Os estudos de docking das variantes demonstraram uma maior afinidade entre o LDLr e a apoB-100 (c.2630C> T; Pro877Leu) em comparação com a proteína não mutada. A troca dos resíduos permaneceu como propriedade físico-química, e comparando as distâncias de ligação das proteínas não-mutadas (5Å) e mutadas (3,5Å), sugere-se uma maior afinidade do complexo (LDLr-apoB-100) para a leucina, tal fato é afirmado pela análise da região de desordens da apoB-100, onde a posição 877 está em uma região desorganizada e flexível. Esta maior afinidade poderia levar a uma menor dissociação intracelular deste complexo, resultando em uma alta taxa de degradação do LDLr pelas enzimas lisossômicas, levando ao aumento da concentração plasmática de LDLc. Para as outras variantes não houve alterações significativas. CONCLUSÃO: Os resultados sugerem que estudos in silico baseados na ferramenta de docking molecular podem melhorar o conhecimento da contribuição genética no desenvolvimento da doença HF. Além disso, a variante APOB c.2630C> T deve ser avaliada in vitropara validação do mecanismo proposto. (AU)

Associação entre o polimorfismo VKORC1: C. 174-136G>A (rs9934438) e a dose semanal de varfarina em pacientes idosos ­ estudo piloto / Association between VKORC1: C.174-136G> A (rs9934438) polymorphism and weekly warfarin dose in elderly patients - pilot study

A varfarina é um anticoagulante utilizado na prevenção e no tratamento de doenças tromboembólicas, com janela terapêutica estreita e, elevado risco de hemorragias. Nos idosos, a principal indicação para tratamento anticoagulante oral é fibrilação atrial, cuja prevalência aumenta com a idade, atingindo 8% após os 80 anos. O exame utilizado para controle da anticoagulação oral é o tempo de protrombina, através do cálculo da razão normalizada internacional (RNI), visando o ajuste de dose e manutenção da faixa terapêutica (RNI= 2 a 3). Os idosos requerem um monitoramento efetivo devido a fatores inerentes da idade. Embora seja conhecido que os fatores genéticos influenciam na resposta terapêutica à varfarina, na rotina da maioria dos hospitais a farmacogenética ainda não é considerada no ajuste de dose. Visando estabelecer uma conduta terapêutica personalizada, o presente estudo tem como objetivo avaliar a associação entre o polimorfismo rs9934438 do gene VKORC1, que codifica a enzima vitamina K epóxido redutase, e a dose semanal de varfarina necessária para atingir o RNI adequado. Até o momento, foram incluídos 52 pacientes com idade superior a 70 anos, de ambos os sexos e em uso de varfarina. A análise do polimorfismofoi realizada através da PCR em tempo real utilizando os reagentes TaqMan™ Sample-to-SNP™ e o sistema de detecção TaqMan® SNP Genotyping Assay. As análises estatísticas foram realizadas utilizando o pacote SPSS v. 16.0 e nível de significância adotado foi de 5%. Dos 52 pacientes incluídos até o momento, 37 (71%) permaneceram na faixa terapêutica (Time in Therapeutic Range, TTR) em pelo menos 50% do tempo de anticoagulação e, para eles a dose semanal de varfarina variou de 15mg a 62,5mg. Apesar de ser um estudo piloto, a distribuição dos genótipos está em equilíbrio gênico, segundo Hardy-Weinberg (AA=19,2%, AG=34,6%, GG= 46,2%, χ2= 3,34 e p=0,067). Para os idosos com TTR ≥50%, a frequência do alelo A foi significantemente maior entre os pacientes que utilizaram doses menores de varfarina (Exato de Fisher, p=0,005). Adicionalmente, os portadores do genótipo AA necessitaram, em média, de aproximadamente metade da dose para atingir a faixa terapêutica quando comparados aos portadores do genótipo GG, 20,5 versus 36,5 mg/semana, respectivamente (ANOVA, p=0,006/ Pós-teste Bonferroni, p=0,039). Os resultados permitem concluir que portadores de alelo A são mais responsivos ao tratamento com varfarina, sugerindo que o perfil genotípico pode ser de grande valor para o direcionamento da dose terapêutica em idosos. (AU)

Adição de plasma seminal ao sêmen descongelado e taxa de prenhez de ovelhas inseminadas em tempo fixo / Addition of seminal plasma to frozen-thawed semen and pregnancy rate of fixed time inseminated ewes

Avaliou-se o efeito da adição de plasma seminal ovino ao sêmen descongelado sobre a taxa de prenhez de ovelhas em rebanho comercial. Cento e setenta e quatro ovelhas cruza Texel foram distribuídas em quatro tratamentos: T1) inseminação artificial cervical (IAC) com sêmen descongelado (SD) diluído em solução tampão fosfato salino (PBS); T2) IAC com SD e adição de plasma seminal ovino; T3) grupo-controle I: IAC com sêmen fresco diluído em PBS; T4) grupo-controle II: inseminação artificial por laparoscopia com SD diluído em PBS. Para indução de cio, utilizaram-se esponjas impregnadas com acetato de medroxiprogesterona (MAP) por 12 dias, com aplicação intramuscular de 400 UI de eCG (Novormon®) e de 37,5µg de cloprostenol sódico (Sincrocio®), no dia da retirada das esponjas. O aparecimento de cio foi monitorado com rufiões vasectomizados a partir da retirada das esponjas até a inseminação artificial em tempo fixo - 54 a 60 horas. A taxa de prenhez do tratamento com adição de plasma seminal ao sêmen descongelado (7,0%) não diferiu (P>0,05) do tratamento sem adição de plasma (4,3%), entretanto foi menor (P<0,05) se comparada à taxa de prenhez dos grupos-controle I inseminação via cervical superficial com sêmen fresco diluído (50,0%) e II inseminação via laparoscopia com sêmen descongelado (39,4%). A inseminação artificial por via cervical superficial com adição de plasma seminal ao sêmen descongelado não elevou o percentual de prenhez em valores que justifiquem a indicação desta biotecnologia em rebanhos comerciais de ovinos.

The effect of seminal plasma addition to thawed-frozen ram semen on the pregnancy rate of commercial herd ewes was evaluated. One hundred and seventy-four crossbred Texel sheep were allocated to four treatments: T1) cervical artificial insemination (CAI) using frozen-thawed semen (FTS) diluted in phosphate buffered saline solution (PBS); T2) CAI using FTS diluted in ovine seminal plasma; T3) control group I: CAI using fresh semen diluted in PBS; T4) control group II: laparoscopic insemination using FTS diluted in PBS. Estrus induction was performed with medroxiprogesterone acetate (MAP) impregnated sponges for 12 days, followed by intramuscular injection of 400 IU of eCG (Novormon®) and 37.5µg of sodium cloprostenol (Sincrocio®) on the day of sponge removal. Estrus was monitorated with vasectomized rams, beginning at the time of the sponge removal until the fixed time artificial insemination - 54 to 60 hours. The pregnancy rate of FTS diluted in seminal plasma treatment (7.0%) did not differ (P>0.05) for the treatment without addition of seminal plasma (4.3%), however it was lower (P<0.05) when compared to the pregnancy rate of the cervical inseminated control I group with PBS diluted fresh semen (50.0%) and laparoscopic inseminated control group II with PBS diluted FTS (39.4%). The cervical artificial insemination with the addition of seminal plasma to frozen-thawed semen did not increase the pregnancy rate at acceptable values to make this biotechnology useful on commercial herds.

Determinação in vitro do potencial antimicrobiano de preparações caseiras de plantas medicinais utilizadas para o tratamento de doenças infecciosas / In vitro determination of the antimicrobial potential of homemade preparations based on medicinal plants used to treat infectious diseases

The majority of the population in developing countries uses plants or plant preparations in their basic health care. Many plant species used nowadays in folk medicine have been proved to have antimicrobial properties. However, several factors, such as incorrect preparation of the plants, can interfere with the effectiveness of the treatment. The purpose of this study was to assess the use of homemade preparations of medicinal plants in the treatment of infectious diseases, by in vitro determination of their antimicrobial potential. Based on recipes elicited by questionnaires that were previously applied to a participant population, the samples were prepared in a similar manner and analyzed by the agar diffusion method. Members of 41 families, whose children attend a center of education that serves several needy communities in the city of Fortaleza (Ceará, Brazil), were interviewed; of these, 97.6% said they had used herbal therapy as a means to treat infectious diseases. In replies to a total of 39 questionnaires, 97 different homemade preparations of medicinal plants were cited. Out of 45 samples subjected to an in vitro assessment of antimicrobial activity, 25 (55.6%) had some inhibitory effect on the growth of at least one of the microorganisms used. Most of the plants with known antimicrobial properties and cited by respondents showed variations in their in vitro activity, according to the manner in which they were prepared.

Grande parte da população de países em desenvolvimento utiliza plantas ou preparações vegetais nos cuidados básicos à saúde. Muitas das espécies vegetais utilizadas na medicina popular apresentam propriedades antimicrobianas comprovadas; no entanto, diversos fatores, como a metodologia incorreta de preparo, podem interferir na eficácia do tratamento. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a utilização de preparações caseiras de plantas medicinais para o tratamento de doenças infecciosas através da determinação in vitro do potencial antimicrobiano. A partir de informações contidas em questionários que foram previamente aplicados à população participante, as amostras foram preparadas de forma semelhante e analisadas através do método de difusão em ágar. Foram entrevistadas 41 famílias, das quais 97,6% afirmaram utilizar as plantas medicinais como opção terapêutica no tratamento de doenças. Em um total de 39 questionários, foram citadas 97 diferentes preparações caseiras de plantas. Das 45 amostras (indicadas para tratar algum sinal ou sintoma que podem estar relacionado a um quadro infeccioso) submetidas à avaliação da atividade antimicrobiana in vitro, 55,6% (25 amostras) apresentaram atividade inibitória sobre o crescimento de pelo menos um dos microrganismos utilizados. A maioria das plantas com propriedade antimicrobiana conhecida e que foram citadas pelos entrevistados apresentaram variações na sua atividade in vitro de acordo com o modo como foram preparadas.

Antimicrobial activity of the essential oil from Lippia sidoides, carvacrol and thymol against oral pathogens.

Dental caries and periodontal disease are associated with oral pathogens. Several plant derivatives have been evaluated with respect to their antimicrobial effects against such pathogenic microorganisms. Lippia sidoides Cham (Verbenaceae), popularly known as "Alecrim-pimenta" is a typical shrub commonly found in the Northeast of Brazil. Many plant species belonging to the genus Lippia yield very fragrant essential oils of potential economic value which are used by the industry for the commercial production of perfumes, creams, lotions, and deodorants. Since the leaves of L. sidoides are also extensively used in popular medicine for the treatment of skin wounds and cuts, the objective of the present study was to evaluate the composition and antimicrobial activity of L. sidoides essential oil. The essential oil was obtained by hydro-distillation and analyzed by GC-MS. Twelve compounds were characterized, having as major constituents thymol (56.7%) and carvacrol (16.7%). The antimicrobial activity of the oil and the major components was tested against cariogenic bacterial species of the genus Streptococcus as well as Candida albicans using the broth dilution and disk diffusion assays. The essential oil and its major components thymol and carvacrol exhibited potent antimicrobial activity against the organisms tested with minimum inhibitory concentrations ranging from 0.625 to 10.0 mg/mL. The most sensitive microorganisms were C. albicans and Streptococcus mutans. The essential oil of L. sidoides and its major components exert promising antimicrobial effects against oral pathogens and suggest its likely usefulness to combat oral microbial growth.

Antimicrobial activity of the essential oil from Lippia sidoides, carvacrol and thymol against oral pathogens

Dental caries and periodontal disease are associated with oral pathogens. Several plant derivatives have been evaluated with respect to their antimicrobial effects against such pathogenic microorganisms. Lippia sidoides Cham (Verbenaceae), popularly known as "Alecrim-pimenta" is a typical shrub commonly found in the Northeast of Brazil. Many plant species belonging to the genus Lippia yield very fragrant essential oils of potential economic value which are used by the industry for the commercial production of perfumes, creams, lotions, and deodorants. Since the leaves of L. sidoides are also extensively used in popular medicine for the treatment of skin wounds and cuts, the objective of the present study was to evaluate the composition and antimicrobial activity of L. sidoides essential oil. The essential oil was obtained by hydro-distillation and analyzed by GC-MS. Twelve compounds were characterized, having as major constituents thymol (56.7 percent) and carvacrol (16.7 percent). The antimicrobial activity of the oil and the major components was tested against cariogenic bacterial species of the genus Streptococcus as well as Candida albicans using the broth dilution and disk diffusion assays. The essential oil and its major components thymol and carvacrol exhibited potent antimicrobial activity against the organisms tested with minimum inhibitory concentrations ranging from 0.625 to 10.0 mg/mL. The most sensitive microorganisms were C. albicans and Streptococcus mutans. The essential oil of L. sidoides and its major components exert promising antimicrobial effects against oral pathogens and suggest its likely usefulness to combat oral microbial growth.